Istraživači na Istraživačkom institutu Scripps (TSRI) i Univerzitetu Vanderbilt napravili su do sada najdetaljniju 3-D sliku membranskog proteina koji je povezan s učenjem, pamćenjem, anksioznošću, bolom i poremećajima mozga kao što su šizofrenija, Parkinsonova bolest, Alchajmerova bolest i autizam.
"Ova porodica receptora je uzbudljiva nova meta za buduće lijekove za liječenje moždanih poremećaja," rekao je P. Jeffrey Conn, PhD, Lee E. Limbird profesor farmakologije i direktor Vanderbilt centra za otkrivanje lijekova u neuronauci, koji je bio viši autor studije sa dr Raymondom Stevensom, profesorom na Odsjeku za integrativnu strukturnu i računarsku biologiju na TSRI. "Ovo novo razumijevanje načina na koji molekuli slični lijekovima angažuju receptore na atomskom nivou obećava da će imati veliki utjecaj na nove napore u otkrivanju lijekova."
Istraživanje – koje se fokusira na mGlu1 receptor – objavljeno je u izdanju časopisa Science od 6. marta 2014.
Porodica mete droge
Receptor mGlu1, koji pomaže u regulaciji neurotransmitera glutamata, pripada superfamiliji molekula poznatih kao G protein-coupled receptors (GPCRs).
GPCR sjede u ćelijskoj membrani i osjećaju različite molekule izvan ćelije, uključujući mirise, hormone, neurotransmitere i svjetlost. Nakon vezivanja ovih molekula, GPCR-ovi pokreću specifičan odgovor unutar ćelije. Više od jedne trećine terapijskih lijekova cilja na GPCR - uključujući lijekove za alergije i srce, lijekove koji ciljaju centralni nervni sistem i antidepresive.
Rad Stevensove laboratorije se vrtio oko određivanja strukture i funkcije GPCR-a. GPCR-ovi nisu dobro shvaćeni i sada se dešavaju mnoga fundamentalna otkrića zbog razumijevanja GPCR-a kao složenih mašina, pažljivo reguliranih kolesterolom i natrijumom.
Kada je Stevensova grupa odlučila da se bavi strukturom mGlu1 i drugih ključnih članova porodice mGlu, bilo je prirodno da su naučnici došli do istraživača u Vanderbiltu. “Oni su najbolji na svijetu u razumijevanju mGlu receptora,” rekao je Stevens. „Saradnjom sa stručnjacima iz specifičnih podfamilija receptora, možemo postići svoj cilj razumijevanja ljudske GPCR superfamilije i načina na koji GPCR kontroliraju signalizaciju ljudskih stanica.”
Dr Colleen Niswender, direktorica molekularne farmakologije i vanredna profesorica farmakologije u Vanderbilt centru za otkrivanje lijekova u neuronauci, također je smatrala da je saradnja imala smisla.“Ovaj rad je iskoristio jedinstvene snage Vanderbilt i Scripps timova u primjeni strukturne biologije, molekularnog modeliranja, farmakologije alosteričnih modulatora i odnosa strukture i aktivnosti kako bi se potvrdila struktura receptora,” rekla je.
Izazov nepoznatog
mGlu1 je bila posebno izazovna tema istraživanja.
Uopšteno govoreći, GPCR-ovi su izuzetno slabašni, krhki proteini kada nisu usidreni unutar njihovih prirodnih ćelijskih membrana. Nagovoriti ih da se postroje kako bi formirali kristale, tako da se njihove strukture mogu odrediti rendgenskom kristalografijom, bio je veliki izazov. A mGlu1 receptor je posebno nezgodan jer, pored domena koji pokriva membranu, ima veliki domen koji se proteže u ekstracelularni prostor. Štaviše, potrebne su dvije kopije ovog multidomenskog receptora koji se povezuje u dimeru za prijenos glutamatnog signala preko membrane.
Zadatak je otežan jer nije postojao šablon za mGlu1 iz blisko povezanih GPCR proteina koji bi vodio istraživače.
“mGlu1 pripada klasi C GPCR-a, od kojih nijedna struktura nije ranije riješena,” rekao je TSRI diplomirani student Chong Wang, prvi autor nove studije sa TSRI diplomiranim studentom Huixian Wuom. „Ovo je učinilo projekat mnogo težim. Nismo mogli koristiti druge GPCR-e kao šablon za dizajniranje konstrukcija za ekspresiju i stabilizaciju ili za pomoć u tumačenju podataka o difrakciji. Struktura je bila toliko različita da su se morale koristiti stare školske metode u određivanju nove strukture proteina.”
Iznenađujući rezultati
Tim je odlučio pokušati utvrditi strukturu mGlu1 vezanog za nove “alosterične modulatore” mGlu1 koje je doprinijela grupa Vanderbilt. Alosterični modulatori se vezuju za mjesto daleko od mjesta vezivanja prirodnog aktivatora (u ovom slučaju, vjerovatno molekula glutamata), ali mijenjaju oblik molekule dovoljno da utječu na funkciju receptora. U slučaju kandidata za alosterične lijekove, nadamo se da spojevi utječu na funkciju receptora na poželjan, terapeutski način.
"Alosterični modulatori su obećavajući kandidati za lijekove jer mogu 'fino podesiti' GPCR funkciju,” rekla je Karen Gregory, bivša postdoktorska koleginica na Univerzitetu Vanderbilt, sada na Monash Institute of Pharmaceutical Sciences. “Međutim, bez dobrog ideja o tome kako jedinjenja slična drogama stupaju u interakciju s receptorom kako bi prilagodili snagu signala, napori u otkrivanju su izazovni."
Tim je nastavio s primjenom kombinacije tehnika, uključujući kristalografiju rendgenskih zraka, odnose strukture i aktivnosti, mutagenezu i modeliranje dimera pune dužine. Na kraju studije, postigli su sliku visoke rezolucije mGlu1 u kompleksu s jednim od kandidata za lijek, kao i dublje razumijevanje funkcije i farmakologije receptora.
Nalazi pokazuju da mGlu1 posjeduje strukturne karakteristike slične i različite od onih koje se mogu vidjeti u drugim klasama GPCR-a, ali na načine koje bi bilo nemoguće unaprijed predvidjeti.
„Najviše iznenađuje to što je ulaz u džep za vezivanje u transmembranskom domenu gotovo u potpunosti prekriven petljama, ograničavajući pristup za vezivanje alosteričnih modulatora,” rekao je Vsevolod „Seva” Katritch, docent molekularne biologije na TSRI i koautor rada. “Ovo je veoma važno za razumijevanje djelovanja alosteričnih modulatora i može djelomično objasniti poteškoće u skriningu za takve lijekove.
“Struktura mGlu1 receptora sada pruža solidnu platformu za mnogo pouzdanije modeliranje blisko povezanih receptora,” nastavio je, “od kojih su neki podjednako važni u otkrivanju lijekova.”
