U biologiji, kao iu nekretninama, lokacija je bitna. Radne kopije aktivnih gena - koje se nazivaju glasničke RNK ili mRNA - strateški su pozicionirane u živim tkivima, a njihova lokacija često pomaže u reguliranju rasta i razvoja stanica i tkiva. Ali da bi analizirali mnoge mRNA istovremeno, naučnici su morali da samelju ćelije u kašu, što im nije ostavilo dobar način da odrede gde se te mRNA nalaze unutar ćelije.
Sada je tim na Wyss Institutu za biološki inspirisano inženjerstvo na Univerzitetu Harvard i Medicinskom fakultetu Harvard, u saradnji sa Allen institutom za nauku o mozgu, razvio novu metodu koja omogućava naučnicima da precizno odrede hiljade mRNA i drugih tipova RNK odjednom u netaknutim ćelijama - sve dok se određuje redoslijed slova ili baza koje ih identificiraju i otkrivaju šta rade.
Metoda, nazvana fluorescentno in situ sekvenciranje RNK (FISSEQ), mogla bi dovesti do ranije dijagnoze raka otkrivanjem molekularnih promjena koje pokreću rak u naizgled zdravom tkivu. Mogao bi pratiti mutacije raka i kako one reaguju na moderne ciljane terapije, te otkriti ciljeve za sigurnije i efikasnije.
Metoda bi takođe mogla pomoći biolozima da shvate kako se tkiva suptilno mijenjaju tokom embrionalnog razvoja - pa čak i da pomogne u mapiranju lavirinta neurona koji povezuju ljudski mozak. Istraživači su ovu metodu izvijestili u današnjem online izdanju Science.
"Smatrajući sveobuhvatno ekspresiju gena unutar ćelija, sada možemo uočiti brojne važne razlike u složenim tkivima poput mozga koje su danas nevidljive," rekao je George Church, dr., član Osnovnog fakulteta u Wyss-u Institut i profesor genetike na medicinskoj školi Harvard. „Ovo će nam pomoći da shvatimo kao nikada do sada kako se tkiva razvijaju i funkcionišu u zdravlju i bolesti."
Zaključavanje RNA na mjestu
Zdrave ljudske ćelije obično uključuju skoro polovinu svojih 20.000 gena u bilo kom trenutku, i pažljivo biraju te gene kako bi proizveli željene ćelijske odgovore. Štaviše, ćelije mogu birati ekspresiju gena gore ili dolje, prilagođavajući se da proizvedu bilo gdje od nekoliko radnih kopija gena do nekoliko hiljada.
Ali istovremeno preciziranje stanične lokacije svih tih mRNA je težak zadatak.
Church i Je Hyuk Lee, Ph. D., istraživač na Wyss Institutu i Harvard Medical School, bili su spremni za izazov. Štaviše, hteli su da istovremeno odrede redosled tih RNK, koji ih identifikuje i često otkriva njihovu funkciju.
Lee i njegove kolege prvo su tretirali tkivo hemijski kako bi fiksirali hiljade RNK ćelije na mestu. Zatim su koristili enzime da kopiraju te RNK u replike DNK i kopirali te replike mnogo puta kako bi stvorili sićušnu kuglicu replike DNK fiksirane na istom mjestu.
Uspeli su da poprave i repliciraju hiljade ćelijskih RNK odjednom - ali su onda postali žrtva sopstvenog uspeha. RNK su bile tako čvrsto zbijene unutar ćelije da čak ni prevareni mikroskop i kamera nisu mogli razlikovati trepćuća svjetla jedne pojedinačne kuglice replike DNK od onih njenih susjeda.
Novi način slikanja RNA
Da bi riješili taj problem, istraživači su uveli nekonvencionalnu metodu za vizualizaciju sićušnih objekata unutar ćelija. Radi kao gradski poštanski sistem. Ako bi upravnik pošte pokušao da identifikuje svaki dom u svom gradu po boji, brzo bi joj ponestalo boja kako bi se novi domovi gradili, što bi rezultiralo nedostavljenom poštom. Umjesto toga, upravnici pošte prate svaki dom tako što mu dodjeljuju jedinstvenu adresu.
Istraživači su shvatili da mogu svakoj RNK u ćeliji dodijeliti jedinstvenu adresu: sekvencu "slova", ili baza, u samoj RNK molekuli. I zaključili su da mogu pročitati adresu koristeći metode slične sekvenciranju DNK sljedeće generacije, skupu brzih metoda sekvenciranja genoma koje je Crkva pomogla razviti početkom 2000-ih.
U sekvenciranju sljedeće generacije, naučnici usitnjavaju tkivo, izvlače njegovu DNK, razbijaju DNK na komadiće, a zatim razrjeđuju te dijelove dovoljno da se svaki komad DNK zalijepi za zasebno mjesto na staklenom predmetu. Oni koriste enzime i četiri različite fluorescentne boje - po jednu za svako od četiri "slova," ili baze - kako bi DNK bljeskala nizom boja koji otkriva njegov slijed.
Po analogiji, naučnici su pokušali da fiksiraju RNK na mestu u ćeliji, da naprave sićušnu kuglicu sa mnogo odgovarajućih DNK replika svake RNK, a zatim da prilagode sekvenciranje DNK sledeće generacije tako da radi u fiksnim ćelijama. Četiri trepćuće boje bi otkrile baznu sekvencu svake replike DNK, koja bi im rekla baznu sekvencu odgovarajuće RNK iz koje je izvedena. A te sekvence bi u teoriji davale neograničen broj jedinstvenih adresa - jednu za svaku od originalnih RNA.
Naučnici su se u početku borili da vizualizuju bljeskajuća svjetla pojedinačnih kuglica replike DNK sa udaljenosti gdje je cijeli pejzaž tkiva ostao na vidiku.
Uspjeli su selektivnim uključivanjem samo djelića tih bljeskajućih tačaka u bilo kojem trenutku, tako da su mogli razlikovati pojedinačne kuglice replike DNK koje bljeskaju po ćelijskom pejzažu.
Međutim, strategija bi funkcionirala samo ako bi zaista mogli pročitati dovoljno osnovne sekvence da daju jedinstvenu adresu. U početku nisu mogli odrediti više od šest baza u replici DNK, što nije dalo dovoljno jedinstvenih adresa za identifikaciju pojedinačnih gena u ljudskom genomu. Tada je Evan Daugharthy, diplomirani student na Harvardskoj medicinskoj školi, uskočio.
FISSEQ na poslu
Daugharthy je prvi osmislio algoritam za lociranje sekvence replike DNK sa poznatom sekvencom gena u ljudskom genomu. Trepćuća svjetla koja ne odgovaraju pravom genu su izbrisana sa slike.
Onda je Daugharthy hakovao komercijalni komplet za sekvenciranje DNK, koji je omogućio timu da sekvencira 30 baza, više nego dovoljno da svakoj replici DNK obezbijedi jedinstvenu adresu. Na ovaj način tim bi mogao stvoriti kompozitnu sliku koja predstavlja sekvencu i lokaciju RNK koja odgovara svakom genu u ljudskom genomu.
Lee, Daugharthy i njihove kolege su zatim testirali metodu za otkrivanje gena koji se ćelije kože uključuju dok se množe i migriraju kako bi zacijelili simuliranu ranu u petrijevoj posudi. Ćelije koje su urasle u ranu imale su 12 gena koji su bili aktivirani mnogo više ili mnogo manje od obližnjih ćelija koje su besposleno sjedile sa strane. Slični eksperimenti mogli bi identificirati nove markere oboljelog tkiva ili nove mete za ciljane molekularne terapije.
"Ono što je Georgeov tim postigao je tehnološki obilazak snage", rekao je osnivač Wyss instituta Don Ingber, MD, Ph. D. "Uočavajući neverovatno suptilne, ali neverovatno važne promene u ekspresiji gena i precizno definisanjem njihovog položaja unutar ćelije, pomogli su da se otvore vrata novom dobu ćelijske dijagnostike."
